Polarisation dynamics and force generation at the B cell immune synapse
Dynamiques de polarisation et génération de forces à la synapse immunologique du lymphocyte B
Résumé
B lymphocytes are able to produce high affinity antibodies against antigens, making them central players of the adaptive immune response. In vivo, their activation typically takes place in secondary lymphoid organs, where they can encounter antigens at the surface of neighbouring cells. The engagement of a B cell receptor (BCR) with its cognate antigen triggers signalling in the B lymphocyte and the formation of an immune synapse between the B cell and the opposing cell. The immune synapse is a communication platform where the B cell gathers information from the opposing surface by accumulating antigen at the centre of the cell-cell contact and reorganizing its organelles to ultimately enable antigen extraction and specific antibody production. Antigen extraction can be achieved through two different pathways: by mechanical pulling on the antigen, or by polarized secretion of proteases at the immune synapse. Both pathways are intimately linked with the cell cytoskeleton, with mechanical extraction relying on actomyosin contractility, based on previous data from the lab, and polarized secretion relying on the polarized reorganisation of the microtubule and actin network. This work focuses on the role of the cytoskeleton in both these pathways, studying (1) the force-generating structures at the B cell immune synapse and their regulation and (2) the role of microtubules and F-actin in regulating dynamics of immune synapse formation and B cell polarization. In a first part, we used a soft substrate grafted with antigen to allow the B cell to extract the antigen mechanically, and to measure the forces applied by the cell in this context using traction force microscopy. This allowed us to uncover an actomyosin-dependent spatiotemporal force patterning at the immune synapse, with tangential forces at the periphery of the immune synapse, and normal, local forces associated with antigen extraction sites and invadosome-like protrusions at the centre of the synapse. These protrusions are also regulated in number, stability, and mobility by signalling and actomyosin contractility. In a second part, we focused on the establishment of polarity in B cells, which is a technical challenge, as this process is occurring in 5-10min. To overcome this difficulty, we designed a custom microfluidic system to reconstitute immune synapses between a B cell and an antigen-coated droplet, and control the time and angle of the contact. With this system, we can image immune synapse formation and B cell polarization from the first instants, which gave us unprecedented insights into this process. A sequence emerged, happening in ~5min: F-actin is transiently nucleated at the immune synapse, then cleared as the centrosome polarizes. The centrosome then detaches from the nucleus, allowing the latter to be transported away from the synapse. The polarization of the centrosome also allows the recruitment of lysosomes, indispensable for protease secretion. Using chemical treatments targeting the cytoskeleton, we were able to establish a map of dependencies of organelle movement during B cell polarization: early events (immune synapse formation - antigen accumulation, cell signaling) highly depend on F-actin, while the establishment and maintenance of cell polarity - including the polarity of actin polymerization- relies on microtubules. By creating a new set of experimental and analytical tools to investigate the dynamics of B cell polarization, we provide an unprecedented systematic characterization of organelles polarization dynamics and organelle-cytoskeleton interactions during B cell polarization, that can bring insights into polarization mechanisms in general. Our results decipher the role of the cell cytoskeleton in different contexts of B lymphocyte activation, immune synapse formation and antigen extraction, and highlight the versatility of B lymphocytes that adapt their behavior to the conditions of antigen presentation.
Les lymphocytes B peuvent produire des anticorps de haute affinité contre les antigènes, ce qui en fait des acteurs centraux de la réponse immunitaire adaptative. In vivo, leur activation a lieu dans les organes lymphoïdes secondaires où ils rencontrent des antigènes à la surface des cellules voisines. Le contact entre un antigène et un récepteur de cellule B qui lui est spécifique déclenche la signalisation du lymphocyte B et la formation d'une synapse immunologique avec la cellule voisine. La synapse immunologique est une plate-forme de communication où le lymphocyte B recueille des informations sur la surface de l'autre cellule en accumulant l'antigène au centre du contact et en réorganisant ses organelles, pour permettre in fine l'extraction d'antigène et la production d'anticorps spécifiques. L'extraction de l'antigène peut être réalisée par deux voies différentes: l'application de forces mécaniques sur l'antigène ou la sécrétion polarisée de protéases au niveau de la synapse immunologique. Les deux voies sont liées au cytosquelette, l'extraction mécanique reposant sur la contractilité de l'actomyosine d'après des observations antérieures du laboratoire, et la sécrétion polarisée reposant sur la réorganisation polarisée des réseaux de microtubule et d'actine. Ce travail se concentre sur le rôle du cytosquelette dans ces deux voies, en étudiant (1) les structures qui génèrent des forces à la synapse immunologique et leur régulation et (2) le rôle du cytosquelette dans la régulation de la dynamique de formation de la synapse immunologique et la polarisation des lymphocytes B. Dans la première partie, nous avons utilisé un substrat déformable couvert d'antigène pour permettre l'extraction mécanique, ainsi que la mesure des forces appliquées par la cellule par microscopie de force de traction. Cela a révélé une organisation spatio-temporelle des forces à la synapse immunologique reposant sur l'activité de l'actomyosine : la périphérie de la synapse présente des forces tangentielles centripètes, alors que le centre de la synapse présente des forces locales normales associées aux sites d'extraction d'antigène et à des protrusions de type invadosome. Le nombre, la mobilité et la stabilité de ces protrusions sont également régulés par la signalisation et la contractilité de l'actomyosine. Dans un second temps, nous nous sommes concentrés sur l'établissement de la polarité du lymphocyte B, ce qui représente un défi technique car ce processus ne dure que 5-10min. Nous avons conçu un système microfluidique pour reconstituer des synapses immunologiques entre un lymphocyte B et une goutte recouverte d'antigène, et contrôler le temps et l'orientation du contact. Avec ce système, nous pouvons imager la formation de synapses et la polarisation des lymphocytes B dès les premiers instants, ce qui nous a permis d'étudier de nombreuses dynamiques de polarisation. Nous proposons une séquence en deux étapes : pendant les premières minutes, l'actine est nucléée à la synapse, ce qui permet l'accumulation de l'antigène et la signalisation. Ensuite, le centrosome se repositionne à la synapse et permets la polarisation des lysosomes puis du noyau. Cette séparation temporelle se retrouve dans les dépendances au cytosquelette : les événements précoces nécessitent l'actine, tandis que l'établissement et le maintien de la polarité cellulaire - dont la polarité de l'actine - repose sur les microtubules. Grace à un nouvel ensemble d'outils expérimentaux et analytiques, nous fournissons une caractérisation systématique de la dynamique de polarisation des organelles et des interactions organelles-cytosquelette pendant la polarisation des cellules B. Nos résultats décrivent le rôle du cytosquelette dans différents contextes d'activation des lymphocytes B, de formation de synapse immunologique et d'extraction d'antigène, et mettent en évidence la polyvalence des lymphocytes B qui adaptent leur comportement aux conditions de présentation de l'antigène.
Origine : Version validée par le jury (STAR)